NUTRIENTES INORGÁNICOS MUESTREO y CONSERVACIÓN: MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS MATERIAL NECESARIO: Guantes de vinilo sin polvo Gradillas y bolsas ziploc Botes o tubos estériles de HDPE o PP Etiquetas Nevera ó congelador Estadillo de muestreo Hielo seco/ acumuladores NO SE DEBEN UTILIZAR ni guantes de neopreno, ni nitrilo son una fuente de contaminación de nitrato, nitrito y amonio. Ojo al diámetro Ojo al volumen y diámetro debe estar acorde con la capacidad y diseño del automuestreador del sistema FIA Los botes o tubos deben ir identificados con una etiqueta que se corresponda inequívocamente con su identificación (ID) específicos para este objetivo deben ser LIMPIO, portátiles o equpos para conservación y/o transporte Ver apartado Los botes o tubos deben ir identificados con una etiqueta que se corresponda inequívocamente con su identificación (ID) Necesarios para el transporte de muestras congeladas  y/o frío HDPE=> High Density PolyEthylene PP=> Polipropileno ALTERNATIVA A BOTES ESTÉRILES (EN CASO DE ANÁLISIS EN FRESCO): Se cogen en botes de plástico estériles de HDPE o PP (propileno). Estos botes serán los que se metan directamente en el muestreador del autoanalizador. En caso de no poder ser estériles, debido al gasto económico así como el volumen de plástico generado, se pueden reutilizar siempre y cuando estén lavados convenientemente. El lavado para macronutrientes (concentraciones micromolares) será: enjuagar con agua destilada, seguido de HCl 10%, y nuevamente con destilada. PROCEDIMIENTO DE MUESTREO: NO SE DEBE FUMAR cerca de la zona de muestreo. Y si hay personas que hayan fumado recientemente deberían estar lejos de las muestras abiertas, ya que fumar puede contaminar las muestras, principalmente las de amonio, nitrato y nitrito. USO DE GUANTES: SE DEBEN UTILIZAR guantes de vinilo sin polvo, NO SE DEBEN UTILIZAR ni guantes de neopreno, ni nitrilo son una fuente de contaminación de nitrato, nitrito y amonio. ORDEN DE MUESTREO: las muestras de nutrientes se deben coger inmediatamente después de los gases, antes de los muestreos biológicos. ETIQUETADO: los tubos deben ir perfectamente etiquetados identificando las muestras recogidas según el muestreo en la roseta o experimento, esta etiqueta-ID debe registrarse en el metadata de ID que se introduce en el sistema FIA de análisis. Ejemplo de metadata de nutrientes. MUESTREO: - no usar tubo de muestreo (silicona o tygon), en caso de usarlo (restricción de agua de la niskin o experimento) se debe limpiar con agua destilada y HCl 10%. - llevar los tubos con ID en la gradilla a la zona de muestreo, deben ir cubiertos en papel de alumnio o dentro de una bolsa ziploc mientras no se muestree - abrir los grifos de la niskin, intentar regular el flujo con la rosca superior, enjuagar con el agua de la roseta tres veces antes de coger la muestra, evitando tocar los grifos con las manos - una vez enjuagado, llenar dos terceras partes del bote/tubo y tapar inmediatamente. Importante dejar suficiente espacio vacío en el tubo/bote para permitir la expansión de la muestra durante su congelación, seguidamente cerrar, apretando bien el tapón. CONSERVACIÓN / PRESERVACIÓN: - CONGELACIÓN: recién muestreadas las muestras se deben congelar en posición vertical, comprobando que las tapas están bien apretadas antes y después de que las muestras se hayan congelado. Las muestras se deben congelar en un equipo específicamente dedicado, limpio, sin material orgánico (muestras de pescado o alimentos) almacenado. Una vez congeladas se pueden almacenar en bolsas ziploc identificadas por lotes. PROCEDIMIENTO DE TRANSPORTE: MUESTRAS CONGELADAS La CADENA de FRÍO no debe romperse: las muestras deberán permanecer siempre congeladas, se utilizarán neveras portátiles para su transporte en hielo seco o acumuladores de frío. BRIEF DESCRIPTION OF THE INORGANIC NUTRIENTS ANALYSIS Inorganic nutrient salts in seawater are determined by SFA (Segmented Flow Autoanalyzer) (Aminot & Kérouel, 2007) with a SEAL Analytical QuAAtro analyzer using colorimetric methods (Hydes et al., 2010 & Becker et al., 2020).Nitrate is measured with Cu-Cd reduction Naphthylenediamine method. Nitrite is determined with Naphthylenediamine method. Silicate is analyzed according to Molybdenum blue method. These methods were described by Grasshoff et al (1983). Phosphate is measured with Molybdenum blue photometric method from Murphy & Riley (1962). Concentrations are given in µmol Kg-1. KANSO-JAMSTEC RMNs (Reference Material for Nutrients in seawater) with different ranges of concentration are used to control de accuracy of our analysis, the RMN  cover the maximum concentration found in the samples. Low Nutrient Seawater (surface seawater filtered and aged) is also used to control low nutrient concentrations. A first quality control procedure is usually performed (if available time) assigning flags to the results (2= good, 3=probably bad, 9= not sampled/analysed). REFERENCES Aminot, A. and R. Kérouel. 2007. Dosage automatique des nutriments dans les eaux marines. 188p. In Methodes d’analyse en milieu marin. Ifremer, ed. Editions 25 Quae. Becker, S.; Aoyama, M.; Woodward, E.M.S.; Bakker, K.; Coverly. S.; Mahaffey, C. and Tanhua, T. (2019) GO-SHIP Repeat Hydrography Nutrient Manual: The precise and accurate determination of dissolved inorganic nutrients in seawater, using Continuous Flow Analysis methods. In: GO-SHIP Repeat Hydrography Manual: A Collection of Expert Reports and Guidelines. Version 1.1, [56pp.]. DOI: http://dx.doi.org/10.25607/OBP-555. Available online at: http://www.go-ship.org/HydroMan.html. Becker S, Aoyama M,Woodward EMS, Bakker K,Coverly S, Mahaffey C and Tanhua T(2020) GO-SHIP Repeat HydrographyNutrient Manual: The Preciseand Accurate Determinationof Dissolved Inorganic Nutrientsin Seawater, Using Continuous FlowAnalysis Methods.Front. Mar. Sci. 7:581790. doi: 10.3389/fmars.2020.581790 Grasshoff, K., Kremling, K., and Ehrhardt, M. (eds), 1983. Determination of nutrients. In Methods of seawater analysis, Germany: Wiley-VCH. Hydes, D. J., Aoyama, M., Aminot, A., Bakker, K., Becker, S., Coverly, S., et al. (2010). Determination of dissolved nutrients (N, P, Si) in seawater with high precision and inter-comparability using gas-segmented continuous flow analysers. GO-SHIP Repeat Hydrography Manual: A collection of expert reports and guidelines. IOCCP report #14, ICPO publications series no.134, Version 1. Updated by Becker et al. (2019) above. Murphy, J. and Riley, J.P., 1962. A modified single solution method for the determination of phosphate in natural waters. Anal. Chim. Acta, 27: 31-36. FORMULARIO DE RECEPCIÓN DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS La recepción de tubos de muestras de nutrientes en INOCEN lab debe ir acompañada del siguiente formulario en formato excel con la información básica de las muestras. Esta información es de obligada recepción para el análisis de las muestras en INOCEN lab. FOTO del formulario LINK al formulario. Descargar, completar y enviar a marta.alvarez@ieo.esPROTOCOLO QUATTRO PUESTA EN MARCHA: -Comprobar caducidad y cantidad de reactivos y patrones. - Comprobar el estado de todos los tubos (un signo de desgaste o rotura se caracteriza por una tonalidad blanquecina en dicha zona) y juntas del circuito. -Sacar los reactivos y patrones de la nevera, porque deben estar a temperatura ambiente cuando se haga el análisis. -Revisar los bidones de residuos estos no deben estar llenos, revisar también el bote de residuos del fluorímetro, en caso de que tenga residuos vaciarlo. Los tubos que hay en este bote no deben de tocar los residuos. -Renovar el agua MQ del diluidor y el de la muestra. -Encender el interruptor de la regleta e interruptores de: sampler, jeringa, quaatro y ordenador. -Ver si están los tubos de aire pinzados, ya que cada semana se deben sacar. Si quedaron pinzados y el equipo estuvo apagado mucho tiempo, se deben mover un poco, para pinzar otra zona. -Poner las tapas de las bombas. -Abrir el nitrógeno, de forma que burbujee lo mínimo. -Abrir el software AACE 7.06 y pinchar en Charting. Aparece una ventana, donde preguntan “Activity Analysis XXX”? si se quiere abrir ese archivo se le dice que si, en caso contrario “change”, y se puede seleccionar otro análisis. Las bombas empiezan a funcionar y se abren 5 gráficas en la pantalla del ordenador, que se corresponden con los 5 canales: 1-nitrato, 2-nitrito, 3-silicato, 4- fosfato, y 5-amonio. Figura 1 -Después de 5 minutos, pasar las varillas que están inmersas en agua MQ a los jabones correspondientes (tritón: nitrato y nitrito, SDS: fosfato y silicato y brij: amonio). -Preparar el reactivo diario: Ácido ascórbico para el canal de fosfato. -Cuando ya tengamos todos los reactivos y por lo menos hayan pasado jabones por las líneas durante 20 minutos, mover las varillas que están inmersas en los jabones a los botes de los reactivos correspondientes, es decir, se hará cuadrar el número de la varilla, con el número de la etiqueta del reactivo. Comprobar que las burbujas fluyen correctamente del mismo tamaño y equidistantes. -Pasado un tiempo (20 minutos) abrir la válvula de la columna para que los reactivos pasen a través de la columna. Para ello pinchar sobre “manifold valve 1”, rodeado en rojo en la figura 2. Aparece una nueva ventana, se pinchará en “on” para encender la válvula, y así permitir el paso de los reactivos a la columna. figura 2 Fijarse en que las temperaturas sean las correspondientes: 1, 2, 3 y 4 25ºC, y 4 a 75ºC. En los métodos ponen que el nitrato y fosfato deben estar a 40ºC pero no tienen baño y el nitrito a 60ºC, y como es la misma reacción que el nitrato no tiene sentido diferente temperatura, así que sólo se enciende el del amonio a 75ºC. Aparece en la ventana Sys 1 como M40 y H75, porque M deben ser lo que le llaman mezcladores en la oferta técnica (página 9) dice que los mezcladores están atemperados a 40ºC. Fijarse en la línea base, deberá ser baja (5%) y estable, no podrá tener ningún pico o irregularidad. Con el botón derecho del ratón presionar sobre SET BASE. PATRONES: Colocar 9 tubos vacíos en la gradilla metálica y en la posición 10 colocar el patrón del que queremos hacer las diluciones pertinentes. Pinchar en el icono de la jeringa “Syringe Diluter” (figura 3), y darle a “reset”, seguidamente pinchar sobre “prime”, en caso de que haya burbujas volver a pulsar sobre prime. Figura 3 Pinchar en SET UP>ANALYSIS, se abre una nueva ventana. En ella se pueden ver todos los análisis que hay guardados. Se puede generar un NEW ANALYSIS, pinchando sobre este botón. En este caso, se debe dar en cada gráfico al botón derecho “set light power2. Diseño de un método: en cada canal hay que poner la temperatura correspondiente, como aparece anteriormente. También se puede generar un NEW RUN. Ponerse encima del .anl y hacer click en NEW RUN. En general, utilizar calibración L (lineal). Cuando la línea base está ruidosa se puede pulsar en lugar de “After last stable baseline”, “before primer rise acceptance”. Para cálculo del rendimiento de la columna: Recovery, en el canal TON la concentración de patrones se pone la de NO3+NO2 y en recovery poner patrones mixed. Figura 4 Aparecerá la siguiente ventana, en Run name, el programa pone por defecto la fecha del análisis. Click sobre OK. Figura 5 Pinchar en el icono del diluidor (rodeado en rojo en la figura 6). Figura 6 Aparece una ventana en que se puede seleccionar un run. Actualmente, se seleccionaría la carpeta Radcor16RadMensual16Copy, dentro de ella se selecciona el run 170123A. Aparece la ventana de la figura 7. Donde pone concentración se escribe la del patrón madre de uno de los canales, en este caso ponemos la del nitrato (257.678), en Volume se escribe 10, y en Pos se escribe la posición donde se coloca el tubo con el patrón, en este caso lo ponemos en la posición 10 de la gradilla. Pinchar start. Cuando acabe, pinchar nuevamente start, para así tener volumen suficiente durante todo el análisis. De esta forma en la posición 1 estará el primer, y en las siguientes los patrones para que el equipo realice su recta de calibrado. Los últimos tubos con esa máxima concentración, son para utilizarlos en las posiciones de Derivas (Drifts), y en el High, para el cálculo de Carryover. Figura 7 Cuando es un nuevo análisis se deben poner las concentraciones de los patrones en cada canal en el apartado Calibrants, como se observa en la figura siguiente. Figura 8 Radcor16RadMensual16Copy>171003G, run utilizado para hacer los patrones del recovery. Importante!!!! Encender el fluorímetro, mientras se hacen los patrones, en caso de que se analice amonio. Pinchar en el icono del muestreador XY2 Sampler 1 (rodeado en rojo en la figura 9), aparece una nueva ventana llamada XY2 Sampler, en ella donde pone Cup position, seleccionar la posición 9 y pinchar en “Sample”, en esta posición tendrá que estar el patrón más concentrado de todos los canales, el ideal, por tanto, para ajustar la ganancia. Éste debe tener la misma concentración que el primer. Esperar un minuto y medio y pinchar en “Wash”. Figura 9 Estar atento a los gráficos de los cinco canales, la línea base comenzará a subir, apareciendo una meseta, como se observa en la figura 10, cuando se mantenga estable en lo alto de la meseta, se le da al botón derecho del ratón, y se pulsará SET GAIN. Hacer esto en cada uno de los canales. Cuando se repita el mismo análisis, patrones,… no hará falta hacer esto todos los días ya que se verá que la ganancia siempre será la misma. Dejar que la línea vuelva a la base y sea estable. Sino baja a 5% darle a botón derecho en cada gráfico y darle a SET BASE. Figura 10 Observando la figura 10, vemos que la señal que sale primero es el fosfato, luego el silicato, el tercero es el TON, cuarto el amonio y el último el nitrito. Esta información es útil, para cuando estemos pendientes de la salida de los primers al principio del run. Mientras baja la señal hacer el Tray protocol, en caso de que no esté hecho. TRAY PROTOCOL: Para hacer el Tray protocol, lo más cómodo es partir de uno ya hecho en otros análisis. Se seguirá el orden que aparece en las figuras 11, 12 y 13. Hay que tener en cuenta que cuando se quieren introducir muestras,…entre unas y otras, si queremos mantener el orden de los patrones… debemos pinchar en FIX, antes de proceder a hacer cualquier cambio. Cup 1, primer: Se coloca el patrón de concentración más alta para todos los canales, ya que es el primer. Cup 2-7, calibrants: Se deben colocar en estas posiciones los patrones en orden creciente de concentración, de manera que la cup 2, tendrá 0 de concentración y la 7 la máxima concentración, que coincide con el primer. Cup 18, drift: Se coloca un tubo con la misma concentración del primer, porque para calcular las derivas se usan las máximas concentraciones, en caso de no tener volumen suficiente de este patrón se cogería la segunda máxima concentración. Cup 8, recovery: patrón sólo de nitrito, debe tener la misma concentración que el patrón de nitrato que se ponga en la cup 9 (2 uM), deben ser de concentraciones equimolares. Estas dos posiciones se utilizan en los cálculos del rendimiento de la columna de Cd. Cup 9, recovery: patrón sólo con nitrato. Cup 1 y 3, carryover: Para el cálculo de carryover, se necesitan tres cups, una de alta de concentración (High) y dos de baja concentración (Low). Por tanto, se ponen como muestras en el Tray Protocol la Cup 1 y Cup 3, la 1 como ya se dijo es el primer por lo que será el High del carryover. En la 3 se pincha sobre el patrón de más baja concentración (sin ser cero). Cup 11-16: seguidamente se leen como muestras, por triplicado el subpatrón (agua de 500m) y un agua control (agua de superficie). Ambas almacenadas en sus bidones correspondientes. Cup 17: RMNS, Reference Material for Nutrients in Seawater (Kanso). A continuación se colocan las muestras, entre grupos de muestras se colocan Null-Baseline- Null. El final de la secuencia se puede ver en la figura 13. Los protocolos se pueden guardar (save) y cargar (load), según nos convenga. Figura 11 Figura 12 Figura 13 Importar un archivo txt al tray protocol Para importar el orden de las muestras, primero tenemos que hacer un archivo .txt con una sólo una columna, donde aparezcan sólo lo que se introduce como muestras, es decir empezaríamos por High cal 6, Low cal 2, Low cal 2, 500, 500, 500, sw, sw, sw, RMNS, y las muestras de ese día por el orden que queramos. A continuación, se importa ese archivo, para ello en Tray Protocol (imagen inferior), se pulsaría IMPORT. Aparece la ventana Configure Import, y aquí se puede seleccionar el archivo deseado. Pulsar en Samples only, de esta forma se mantendrá el orden de los patrones, baseline, nulls,…y sólo importa las muestras. Apply. Next. Si pone “na” hay que abrir la pestañita y seleccionar Sample ID. OK. INICIAR LA SERIE Cuando la línea base sea estable y baja (5%), se puede iniciar el run. Seleccionar el run que se creó y pinchar en RUN: Click sobre RUN, aparece nuevamente la pantalla anterior donde seleccionas el análisis y el run que acabas de crear, cuando estés sobre dicho run, se le da a OK y aparece la siguiente pantalla: -OK, otra vez y comenzará la serie, el programa automáticamente comenzará a buscar la línea base, cuando la encuentre (en los cinco canales), la aguja del muestreador pinchará sobre el tubo que esté en la posición 6 de la gradilla1, este tubo es el PRIMER (patrón más concentrado). Mientras el equipo se va estabilizando…aprovechar para colocar los tubos correspondientes, en el orden que aparece en la solapa TRAY PROTOCOL del análisis que vayamos a utilizar. En caso de no encontrar el primer: se pararía la serie y se deja que el equipo funcione con MQ en el circuito de la línea base, y con reactivos en el resto. Esperar a que los picos debidos al primer que ha aspirado pero que no ha reconocido salgan del detector, es decir que baje la línea base y sea estable. Empezar otra vez. Durante la serie se debe estar atento a que no se acabe ningún reactivo. PROTOCOLO DE PARADA -Una vez que desaparezcan todas las pantallas de gráficos y aparece el report y un mensaje que el run se ha acabado, se le da al OK, el report se cierra pero no hace falta guardarlo. -Apagar la válvula de la columna, para ello primero se pulsa en charting: -Seguidamente, se pincha sobre “manifold valve 1”, rodeado en rojo en la siguiente figura. Aparece una nueva ventana, se pinchará en “off”. Para confirmar que se ha apagado la válvula, nos fijaremos en que el led rojo que hay al lado de la válvula, esté apagado. -Sacar reactivos, limpiar las varillas con papel y poner las varillas de estos en lejía, cada canal en su bote correspondiente, dejarlo encendido durante 10 minutos. Cambiar las varillas a MQ, durante otros 10 minutos. Otros 10 minutos en HCl. Para finalizar 10 minutos en agua MQ. -Los reactivos 1, 2, 3, 7 y 8 se deben guardar en la nevera. 4, 5, 6, 9, 10 y 11 en el mueble de reactivos. -Apagar el equipo, se apaga de derecha a izquierda, es decir el muestreador, el diluidor, el Quaatro y el ordenador. -Cerrar el Nitrógeno. -Sacar las tapas de las bombas. -Apagar la regleta. -Despinzar los tubos del aire, si va a estar apagado mucho tiempo.